聚丙烯酰胺凝胶电泳中的常见问题

在SDS-PAGE不连续电泳中，使用Tris-HCL缓冲体系制备凝胶缓冲液，浓缩凝胶的pH为6.7，分离凝胶的pH为8.9。Tris -甘氨酸缓冲系统用于电泳缓冲液。在浓缩凝胶中，pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸很少解离，在电场作用下，其游动效率较低。而CL离子很高，两者之间形成一个低电导率的区域，蛋白质分子在两者之间游走。由于电导率与电场强度成反比，在这个区域形成高电压梯度，压迫蛋白质分子聚集在一起，集中到一个狭窄的区域。当样品进入分离凝胶时，由于凝胶内pH值升高，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接排在氯离子后面。同时，由于分离凝胶孔径的减小，蛋白质分子在电场的作用下，根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

因此，pH值对整个反应体系的影响是非常重要的。如果在实验中排除其他因素后问题不能很好的解决，首先要考虑这个因素。当然，其他因素也可以从多方面考虑。

样品怎么处理？

根据样品分离的目的不同，主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理和还原SDS加烷基化处理。

1)还原SDS处理:在加样缓冲液中加入SDS和DTT(或β-巯基乙醇)后，蛋白质构象解离，电荷中和，形成SDS与蛋白质结合的分子，电泳中仅通过分子量分离。一般电泳都是这样处理的。将样品稀释至适当浓度，加入上样缓冲液，离心，在沸水中煮沸5分钟，然后离心加入样品。

2)烷基化还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化能长时间很好很牢固地保护SH基，得到一个窄带；此外，碘乙酸胺可以捕获过量的DTT，防止银染过程中的纹理现象。100ul样品缓冲液含10ul 20%胺碘乙酸盐，室温下保温30分钟。

3)非还原3明SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品一般在1%SDS的沸水中煮沸3分钟，不加还原剂，因此蛋白质折叠未被破坏，不能用于分子量测定。

3.SDS-PAGE凝胶中主要成分的作用是什么？

聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，它的固化直接关系到电泳的成功，与凝固剂和环境密切相关；

成胶缓冲液:浓缩胶选用pH6.8，分离胶选用pH8.8。选择Tris-HCl体系、TEMED和AP: AP催化剂催化单丙烯和二丙烯聚合生成聚丙烯酰胺。四甲基乙二胺；混凝剂；加速AP催化；十二烷基硫酸钠(SDS):阴离子去污剂，具有去除蛋白质电荷、解离蛋白质间氢键、去除蛋白质分子内疏水相互作用、去除多肽折叠四大功能。

如何提高SDS-PAGE电泳的分辨率？

聚丙烯酰胺的充分聚合可以提高凝胶的分辨率。建议做法:凝胶在室温下凝固后，可以在室温下使用一段时间。避免即用型或4度冰箱，前者可能导致凝血不充分，后者可能导致SDS结晶。一般凝胶在室温下可以保存4天，SDS可以水解聚丙烯酰胺。

一般常用的染料有三种:氨基黑、考马斯亮蓝、银染，不同的染料有各自不同的染色方法。详见郭主编的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

⒌“微笑”(两边向上翘，中间凹)的原因是什么？

主要是由于凝胶中间部分固化不均匀，往往出现在较厚的凝胶中。

处理方法:待其完全固化后再进行后续实验。

[6]“皱眉”(中间向下两边凸出)丝带的原因是什么？

主要出现在蛋白质立式电泳槽中，一般两板底部缝隙中的气泡没有完全去除。

解决方法:可以在两块板之间加入适量的缓冲液，消除气泡。

⒎为什么皮带会出现拖尾现象？

主要是样品熔化效果不好或者分离胶浓度过大造成的。另外可能是灌胶时分离胶太多，导致浓缩胶太少，起不到浓缩作用，没有把样品压成一条线。

处理方法:加样前离心；选择合适的样品缓冲液，加入适量的样品促进剂；电泳缓冲液太长，需要重新配制；降低凝胶浓度；倒胶时不要分太多胶。

⒏为什么乐队会出现纹理现象？

主要是样品中的不溶性颗粒造成的。

处理方法:加样前离心；加入适量的样品促进溶剂。

什么是“鬼带”，如何应对？

“鬼区”是指在运行具有复杂大分子构象的蛋白质分子时，一些未知的大分子条带经常出现在泳道顶部(有时在浓缩凝胶中)或沉淀在加样孔底部。主要原因是还原剂在加热过程中被氧化，失去活性，使之前解离的蛋白质分子重新折叠、结合，重新与亚基缔合，聚合成分子量大于目标条带的大分子，有时无法进入分离凝胶。但在靶条中具有相同的免疫活性，在WB反应中能与靶条对应的抗体反应。

处理:加热煮沸后，加入适量DTT或β巯基乙醇补充不足的还原剂；或者可以加入适量的EDTA来防止还原剂的氧化。

⒑为什么溴酚蓝不能起指示作用？

在实验中，我们经常会遇到溴酚蓝已经跑出板底，而蛋白质却没有的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

解决方法:更换缓冲器；具有正确的pH值；降低分离胶的浓度。

⑴为什么电泳带会很粗？

电泳出现粗条带是很常见的，主要是浓度差。

解决方法:适当增加浓缩胶的长度；确保浓胶贮存液的pH值正确(6.7)；适当降低电压；

5]为什么电泳电压高，电流低？

这种现象对于初学者来说很常见。比如电压在50v以上，电流却在5mA以下。主要原因是电泳槽组装不当，电流没有形成通路。包括以下步骤:a .将内外槽反向安装；b .外罐内液体过少；c .电泳槽底部的绝缘体没有拆下来(比如灌胶用的橡胶皮)。

解决方法:电泳槽可以正确组装。

⒔分离胶和浓缩胶破裂，板间有气泡影响电泳吗？

这主要出现在初学者中，一般对电泳没有太大影响。前者主要是拔梳子时用力不均或过猛造成的；后者是因为松开制胶夹具后，板材没有压紧，空气进入造成的。

5.凝胶时间不对，慢或快。发生了什么事?

通常，胶水会在30分钟-1H内凝固。如果凝血过慢，可能是TEMED，APS剂量不足或无效。APS应该可以使用了。TEMED不稳定，容易氧化成黄色。如果凝血过快，可能是APS和TEMED用多了。这时候胶水太硬容易开裂，电泳的时候容易烫伤。

5]电泳时间比正常长？

可能是由于凝胶缓冲体系和电缓冲体系的PH值选择错误，即缓冲体系的PH值与被分离物质的等电点相差过小，或者缓冲体系的离子强度过高。

【6】为什么加完分离胶后要马上加水？

加入分离凝胶后，立即用一层双蒸水覆盖。第一，为了保持分离凝胶的界面水平，水可以使其变平，使蛋白质分子在同一水平面上运行；二是防止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制。

⒘制备连续分离凝胶体系(凝胶板厚度0.75mm，长度10cm)100ml体系:双蒸水37.5ml

尿液20-50克

10×TBE缓冲液8毫升

30%丙烯酰胺10毫升

APS(过硫酸铵)500-800 ul[注:随时可用]

TEMED(四甲基乙二胺)23.5微升