跪求实验计划刻不容缓。关于植物小分子肽的提取、分离和分析，最好使用高效液相萃取。
1分离方法
采用什么样的分离纯化方法取决于提取的组织材料和待提取物质的性质。提取和分离蛋白质和肽的常用方法包括盐析、超滤、凝胶过滤、等电沉淀、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分馏、酶水解等。这些方法经常结合起来分离和纯化特定的物质，这些方法也常用于蛋白质和肽的分析，如色谱和游泳。
1.1高效液相色谱
高效液相色谱的出现为多肽的分离提供了有利的方法，因为与其他化合物相比，蛋白质和多肽的高效液相色谱应用不仅可以在合适的色谱条件下短时间内完成分离，更重要的是高效液相色谱可以在制备规模上生产生物活性肽。因此，许多学者做了大量的工作来寻找多肽分离制备的最佳条件。如何保持多肽的活性，如何选择固定相材料，洗脱剂的种类，如何分析测定都是目前研究的内容。
1.1.1 RP-HPLC
结果与保留值的关系:要用RP-HPLC分离多肽，首先要测定不同结构的多肽在色谱柱上的保留值。为了得到一系列的保留系数，Wilce等人用多元线性回归方法分析了265，438+006种多肽的保留性质和结构，得到了不同氨基酸组成与保留系数的关系。其中，由2 ~ 20个氨基酸组成的肽段中的极性氨基酸残基可以减少在柱上的保留时间；在由10 ~ 60个氨基酸组成的小肽中，更多的非极性氨基酸也可以减少在柱上的保留时间，而在含有5 ~ 25个氨基酸的小肽中，非极性氨基酸的增加可以延长在柱上的保留时间。同时，许多文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留的影响，通过计算机处理和分析，获得了各多肽分离提取的最佳条件。
肽图谱:肽图谱是根据蛋白质、多肽的分子量和氨基酸组成的特点，利用一种高度特异性的蛋白水解酶[通常是内肽酶]作用于特定的肽链位点，将多肽裂解成小片段，并通过一定的分离检测手段形成特征指纹图谱。肽图谱对多肽结构的研究和特性的鉴定具有重要意义。基于胰蛋白酶能特异性作用于Arg和Lys羧基端肽链的特性，采用C18色谱柱，通过反相高效液相色谱法检测重组人生长激素的特征肽图。同时，胰岛素的肽图也是通过V8酶特异性切割制备的，它可以识别只有一个氨基酸差异的不同物种的胰岛素。抗人肿瘤坏死因子单克隆抗体的结构也通过酶解和在线分析技术确定，便于鉴定和分析。这项技术已被广泛用于新药的开发。
1.1.2疏水作用色谱(HIC)
HIC利用多肽中含有的疏水基因与固定相产生疏水相互作用，达到分离分析的目的，具有多肽变性比RP-GPLC小的特点。GIC分离的GH产物的结构和活性比EP-GPLC分离的产物更稳定。耿等利用HIC柱的低变性特性，通过盐酸胍乙啶对大肠杆菌的表达进行变性，获得人重组干扰素-γ。高生物活性的产物经HIC柱纯化和折叠。不同的人尿表皮生长因子(EGF)也经HIC纯化，均具有良好的生物活性。HIC可以不用离子交换柱纯化样品。但反相高效液相色谱法不能满足这一要求。
1.1.3分子大小排阻色谱(秒)
SEC是利用多肽分子大小和形状的差异来分离纯化多肽物质，特别是对于一些大的聚集分子，如人重组生长激素(hgH)。不同结构和构型的GHs在SEC柱上的分离行为是完全不同的，因此可以分离不同构型或氨基酸序列略有差异的变体。用SEC研究了修饰PEG的分离方法，该PEC具有半衰期长、作用强的特点。用这种方法可以分离和分析一些大分子量的肽或蛋白质。
1.1.4离子交换色谱(IEXC)
IEXC可以利用肽的不同电荷，在中性条件下分离纯化具有生物活性的肽。可分为阳离子柱和阴离子柱，还有一些新型树脂，如大孔树脂、均相树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。在多肽的分离分析中，对多肽的性质、洗脱剂和洗脱条件的研究很多，不同的分离条件也不同，尤其是洗脱剂的离子强度和盐浓度对纯化的影响很大。吴等报道了用离子交换柱色谱法分离牛碳酸酐异构体、牛血清白蛋白和鸡血清蛋白酶的萃取条件，为今后此类物质的分离获得了有价值的数据。
1.1.5膜蛋白(CMP)层析
在强菜类水性蛋白质和多肽混合物的CMP+分离色谱系统中，一般用去污剂(如SDS)溶解膜蛋白，形成SDS融合膜蛋白，用以羟基磷灰石为固定相的柱分离纯化。羟基磷灰石柱既有阴离子磷酸基团(P端)，又有阳离子钙(C端)，与固定相的结合主要由膜蛋白的大小和SDS结合量决定。用原子散射法研究了cAMP的分离机理。发现样品与SDS结合后，在离子交换柱上的固定相中SDS分子、带电荷氨基酸和带电荷离子之间存在交换，从而达到分类分离的目的。
1.1.6高效置换色谱(HPDC)
HPDC是利用小分子高效置换剂在色谱柱上交换样品，从而达到分离的目的。它具有分离含量较少的组分的特点。HPDC分离出活性重组人生长激素(rHG ),占总量的65438±0%。Jayarama发现硫酸地特兰(DS)是β乳球蛋白A和B的良好替代品，DS的相对分子量一般为1×104和4×104。研究表明，置换剂的相对分子量越低，越容易与固定化结合。因此，当分离低相对分子量的肽时，需要较小的置换器来置换和纯化它们。
1.1.7灌注色谱(PC)
PC是一种基于分子筛原理和高速流动相的色谱分离方法。固定相的孔径和流动相的速度直接影响分离效果。实验表明，其在生产制备过程中具有低投入高产出的特点。目前市场上有多种PC固定相可供选择，适用于不同分子量多肽的分离和使用。
1.2亲和色谱(AC)
AC是一种色谱方法，通过利用附着在固定相基质上的配体与能与其特异性相互作用的配体之间的特异性亲和力来分离物质。自从Cuatrecasas在1968中提出亲和层析的概念以来，在寻找特异性亲和物质的过程中发现了许多组合，如抗原-抗体、酶催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸及其互补链等。目前，单克隆抗体或仿生配体主要用于多肽的分离，这些配体根据其结构有天然合成的，也有人工合成的。Patel等人通过一系列亲和柱分离和纯化了组织血浆纤溶酶原激活物蛋白多肽。
固定化金属亲和色谱(LMAC)是近年来发展起来的一种亲和方法。一些金属离子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等。螯合在固定相基质上。该柱可以螯合侧链含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和his的多肽，特别是肽序列中含有His-X-X-X-His的结构，最容易与金属离子亲和柱结合，纯化效果好。其中，胰岛素样生长因子(IGF)和二氢叶还原酶融合蛋白通过该方法被分离成高纯度的产品。
Chaiken等人报道了另一种亲和层析方法，它是由反义DNA表达产生的，与正链DNA表达产生的肽或蛋白质有一定的亲和力，如Arg加压素受体复合物，已用这种方法分离。DNA与蛋白质、多肽复合物的相互作用也是生物亲和中常用的方法。合成的寡核苷酸结合在固定相基质上，样品蛋白或多肽流过柱子，结合上特定结构的多肽就可以分离出来。
毛细管电泳(CE) -分离和分析方法
CE是Hjerten在60年代末在传统电泳技术的基础上发明的。它用小毛细管代替传统的大电泳槽，使电泳效率提高了几十倍。该技术自20世纪80年代以来发展迅速，是生化分析师和生化学家分离和表征肽和蛋白质的有利工具。根据不同的应用原则，CE可分为以下几类:毛细管区带电泳(CZE)、毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管凝胶电泳(毛细管凝胶电泳，CGE)和胶束电动毛细管色谱(MECC)。
毛细管区带电泳(CZE)1 . 3 . 1
CZE对多肽的分离主要是由不同组分的化合物带电决定的，比传统的凝胶电泳更准确。目前多肽物质的CZE分离分析存在的主要问题是天然蛋白质或多肽在毛细管硅胶柱上易与硅醇反应，影响峰形和电泳时间。许多学者做了大量实验来改善这些问题，如调节电池电泳液的PH值，减少与硅醇反应的极性基团；通过改进毛细管柱材料的组成，根据多肽的不同性质，采用不同的CZE方法分离了5种9种氨基酸残基的小肽，确定了小肽分析的基本条件，即在低PH下，缓冲溶液中含有一定浓度的Zn2+等金属离子，分离速度快、准确。
1.3.2毛细管电泳聚焦(CIEF)
由于不同的蛋白质和肽具有不同的等电点(PI)，它们可以在不同pH梯度的电泳槽中在等电点pH的条件下聚集和沉淀，并与其他肽分离。CIEF在混合多肽物质的分离分析中应用不多，主要用于不同来源多肽异构体的分离，如rHG不同异构体的分离。CIEF柱表面覆盖层的不稳定性限制了这种方法的广泛应用。
1.3.3毛细管凝胶电泳(CGE)
CGE是基于分子筛的原理。用十二烷基磺酸钠(SDS)处理的蛋白质或多肽在电泳过程中主要通过不同的分子形状和分子量来分离。目前，另一种非交联、线性和疏水性聚合物凝胶柱用于分离和分析多肽物质。这种电泳方法适用于具有更多疏水侧链的肽的分离。这种凝胶易于倾倒，使用寿命长，性能稳定。
1.3.4胶束电动毛细管色谱(MECC)
MECC的原理是在电泳液中加入表面活性剂，如SDS，使一些带相同电荷的中性分子得以分离。特别是对于一些小分子肽，阴、阳离子表面活性剂的应用可以使其形成带有一定电荷的胶束，从而获得良好的分离效果。有文献报道，在电解液中加入环糊精等物质时，含有疏水结构成分的多肽可以选择性地与环糊精的环孔相互作用，从而通过疏水作用分离多肽。
1.4多肽蛋白质分离项目的系统化应用。
上述分离多肽的技术在实际应用中经常结合使用，根据分离多肽的不同性质采用不同的分离方法。特别是在后基因组时代，为了对蛋白质组的深入研究，人们不断改进分离肽和蛋白质的手段，综合利用蛋白质和肽的性质，采用上述常规的蛋白质多肽提取方法，并利用高效液相色谱、毛细管电泳、双向电泳等手段，从细胞或组织中分离尽可能多的蛋白质多肽。蛋白质和多肽分离鉴定技术在蛋白质组学研究中的系统应用，既是一种分离方法，也是一种分析方法。特别是下面提到的质谱技术的发展极大地提高了蛋白质多肽的分析和鉴定效率。
2分析方法
2.1质谱，MS)
质谱已广泛应用于蛋白质和多肽分析，特别是分离纯化后的在线分析，其高灵敏度和快速性特别适合多肽物质的分析和鉴定。其中，连续流快原子轰击(CF-Fab)和电喷雾电离(EIS)是近年来发展起来的新方法。
2.1.1连续流快原子轰击(CF-Fab)。
Cf-FAB是一种弱电离技术，它可以将肽或小分子量蛋白质电离成MH+或(M-H)形式。主要用于肽段的分离检测，中等分辨率，准确度大于+0.2amu，流速一般为0.5-1.5 μ l mL-1。测定时流动相中应加入0.5%-10%的基质如甘油和高有机溶剂，使样品在检测探针处增敏。Cf-FAB常与HPLC、CEZ等方法联用，以达到分离分析的目的。许多肽的cf-FAB分析方法已经建立并得到了很好的应用。例如，Hideaki等人用这种方法研究了L-Pro和L-Ala的四肽系列。证明L-Pro能维持小肽的相稳定性。在连接分子方面意义重大。
2.1.2电喷雾电离质谱(EIS)
EIS可以产生多价离子化蛋白质或多肽，允许分析相对分子量为1×105的蛋白质，分辨率为1500-2000amu。精度约为0.01%。EIS更适用于分子量相对较大的蛋白质的在线分析，需要气化或有机溶剂使样品敏化。用电化学阻抗法和高效液相色谱法成功地分离和分析了生长激素和血红蛋白，并可与CEZ联用。
2.1.3基质相关激光解吸电离/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。
MALDI-TOF是目前蛋白质鉴定中测定分子量的一种准确方法，特别适用于高灵敏度、高分辨率的混合蛋白质和多肽物质相对分子量的测定。它是目前蛋白质组学研究的必备工具。同时结合液相色谱，可以高效的鉴定多肽类物质。尤其是串联应用各种原理的质谱，不仅可以获得多肽的相对分子量信息，还可以确定其序列结构，这将在未来的蛋白质组学研究中起到决定性的作用。
2.2核磁共振(NMR)
由于光谱信号的纯数字化、太宽的重叠范围(由于相对分子量太大)和弱的核信号，NMR没有广泛用于蛋白质和肽的分析。随着二维、三维和四维核磁共振的应用，分子生物学和计算机处理技术的发展，核磁共振逐渐成为分析这类物质的主要方法之一。核磁共振可以用来确定氨基酸序列和量化混合物中每种成分的组成。然而，在蛋白质分析中仍有许多问题需要解决，如如何使分子量大的蛋白质具有特定的形状以便于定量和定性分析，以及如何减少数据处理的时间。许多学者正在研究这些问题。核磁共振虽然在蛋白质分析中应用很少，但在分析分子中少于30个氨基酸的小肽时非常有用，可以克服蛋白质分析的缺点，达到快速准确分析的目的。
2.3其他
除了上述方法之外，氨基酸组成分析、氨基酸序列分析、现场分析质谱、IR、UV光谱、CD、环形色谱、生物鉴定、放射性同位素标记和免疫学方法都已经应用于多肽物质的结果鉴定、分析和检测。
本文简要介绍了近年来多肽物质分离分析的常用方法和最新研究方向。随着科学技术的不断发展，许多更新的分离分析方法将会出现，因此该领域的研究具有广阔的前景。
SDS-PAGE在展示小分子肽中的应用
SDS-PAGE广泛应用于蛋白质的分离、鉴定和纯化。其有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度。其孔径随着双丙烯酰胺与丙烯酰胺比例的增加而减小，在接近1: 20时达到最小值。分子量低于10kD的小分子肽，即使用高浓度聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE也不能完全分离，或者不优秀，或者带弱且分散。而且分子量越小，效果越差。
为了在SDS-PAGE上展示小分子量的多肽，通常采用两种方法:一种是提高凝胶的浓度和交联度，加入一些能减小聚丙烯酰胺凝胶网孔孔径的溶质分子，使用尿素、甘油或蔗糖等物质；二是选择缓冲液中拖尾离子的种类和浓度，提高多肽的分离效果。
操作程序
1.电泳缓冲液的制备如下表所示。
缓冲液Tris
三嗪(摩尔/升)
(摩尔/升)十二烷基硫酸钠
(%)
阳极缓冲溶液
阴极缓冲溶液
胶水缓冲液0.2
0.1
3.0—
0.1
—8.9*
8.25**
8.4*—
0.1
0.3
*用盐酸调节pH值。
* * The值约为8.25。
2.丙烯酰胺储存液的制备
单丙基-二丙基混合物单丙基百分比和二丙基百分比
49.5% T，3%C
49.5% T，6%C48
46.51.5
3.0
t:丙烯酰胺的总浓度。
c:交联度
3.胶的制备，与一般SDS-PAGE类似，分离胶和浓缩胶按照下表制备。
成分分离胶
16% T，6%C浓缩胶
6% T，3%C
49.5% T，3%C丙烯酰胺溶液(毫升)
49.5% T，6%C丙烯酰胺溶液(毫升)
凝胶缓冲液(毫升)
尿素(克)[甘油(毫升)]
水(毫升)
10%过硫酸铵(微升)
TEMED(微升)
总体积(毫升)
3.3
3.3
3.6[2.4]
1
40
4.0
10.040.48
—
1.00
—
1.50
25
2.5
3.03
4.样本缓冲区
4%十二烷基硫酸钠
12%甘油
50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷
2%巯基乙醇
0.01% Serva蓝
将多肽样品与样品缓冲液混合，煮沸2分钟(或40℃水浴30分钟)。
5.将充满胶水的玻璃板固定在电泳装置上，用1%琼脂糖封边，倒入阴极缓冲液，依次加入样品。
6.将电泳仪放入电泳槽中，倒入阳极缓冲液，将阳极和阴极与电泳仪连接，保持恒定电压在50~60V。指示剂进入分离凝胶后，电压可升至70~90V，恒压约3h即停止电泳。
7.染色、脱色、保胶同SDS-PAGE。